微生物转化发酵法生产天然香料β-苯乙醇的研究
摘 要：本论文以克鲁维氏酵母细胞生物转化生成的天然香料β-苯乙醇为研究对象，主要研内容包括：转化 L-苯丙氨酸生成 β-苯乙醇酵母菌株的确定；发酵液中底物和产物的定量检测方法；摇瓶培养，包括培养基组成的优化及培养工艺
优化；原生质体的制备以及底物诱变，抗反馈抑制优化；β-苯乙醇的结构鉴定。
从实验室保藏的菌种中筛选出一株克鲁维氏酵母：Kluyveromyces marxious ，能够将L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇。根据 L-丙氨酸和 β-苯乙醇的化学结构特征，建立了测定发酵液中底物和产物的方法：高效液相色谱法测定β-苯乙醇；高效液相色谱法测定底物 L-苯丙氨酸；该法处理简单、快速、定量准确、回收率高、重复性好，可有效的用于β-苯乙醇产生菌的菌种选育和发酵
工艺研究中。
为了提高产物浓度，对培养基配方和发酵条件进行优化，确定了优化了的培
养条件： 菌种培养基（YPD）:酵母浸膏 10g/L, 蛋白胨20g、L, 葡萄糖20g/L 发酵培养基：蔗糖 35g/L、L-苯丙氨酸 6g/L,磷酸二氢钾 0.4g/L，YNB1.8g/L；
种子培养基培养 24h，接种量 6%，优化培养基初始 pH=5.5，装液量 50mL/250mL，温 28℃，转速 220r/min，在此条件下发酵 48h 。
关键词：克鲁维酵母，微生物转化，L-苯丙氨酸，β-苯乙醇
目 录
中文摘要 I
英文摘要 III
目录 v
1. 绪论 1
1.1 产品概述 2
1.1.1产品理化性质 2
1.1.2 2-苯乙醇用途及市场状况 2
1.2国内外技术发展概况和发展趋势 3
1.2.1 2-苯乙醇的化学合成 3
1.2.2 生物转化法生产2-苯乙醇 4
1.2.2.1合成2-苯乙醇的代谢图径…………………………………………4
1.2. 2.2合成2-苯乙醇德的微生物…………………………………………5
1.2.3发酵液中2-苯乙醇提取研究概况……………………………………5
1.2.4发展趋势………………………………………………………………6
1.3本课题的研究意义………………………………………………………….6
1.4本课题的研究任务………………………………………………………….7 1.4.1技术路线………………………………………………………………7
1.4.2本课题的主要研究内容………………………………………………7
2．实验部分 8
2.1 实验材料 8
2.1.1 材料 8
2.1.1.1试剂与原材料…………………………………………………….8
2.1.1.2仪器与设备……………………………………………………….8
2.1.1.3微生物菌种……………………………………………………….9
2.1.2 培养基 9
2.2 实验方法 9
2.2.1 菌种培养方法 9
2.2.2 菌种初筛 9
2.2.3 菌种复筛 10
2.2.4 高效液相色谱测定发酵液中L-苯丙氨酸和2-苯乙醇 10
2.3结果与讨论……………………………………………………………….10
2.3.1菌种初筛……………………………………………………………10
2.3.2菌种复筛……………………………………………………………10
2.3.3 高效液相色谱测定底物和产物方法的建立…………………….11
2.3.3.1L-苯丙氨酸和2-苯乙醇标准液的配制……………………..11
2.3.3.2检测波长的确定………………………………………………11
2.3.4流动相和流速的确定……………………………………………….12
2.3.4.1标准曲线的绘制………………………………………………12
2.3.4.2标样及样品分离谱图…………………………………………14
2.4 原生质体制备…………………………………………………………16
2.4.1原生质体观察…………………………………………………….16
2.4.2原生质体再生率………………………………………………….16
2.4.3原生质体诱变…………………………………………………….16
3 结果与讨论 17
3.1 影响原生质体形成因素 17
3.1.1 酶解温度的影响 173.1.2 酶解时间的影响 ……………………………………………………17
3.1.3 显微镜镜检原生质体 18
3.2 紫外诱变剂量选择 18
4 总结与展望 19
4.1 总结 19
4.2 展望 20
致谢 21
参考文献 22
