甲壳素酶的初步研究

摘 要：甲壳素是一种极其有前途和极其重要的天然高分子可再生的物质，是不造成环境污染的新型高分子材料。近年来甲壳素酶在生物防治、医药等领域的研究与开发引起了国内外普遍关注。甲壳素酶主要产生于微生物，其降解产物应用极其广泛。本研究主要是采用固体平板分离纯化及初筛甲壳素酶产生菌株，同时利用液体发酵进行复筛，结果得到一株甲壳素酶高产芽孢杆菌，编号为菌株2-3，产甲壳素酶活能力最强，达284U/ml。并对甲壳素酶的部分酶学性质进行研究，按照实验的酶活力测定方法，得出甲壳素酶的最适底物为胶体甲壳素，最适pH为6.5，最适催化反应温度为60℃，反应温度较高有利于甲壳素酶解反应的进行。此外，通过盐析实验，得到甲壳素酶的最佳(NH4)2SO4盐析浓度是70%饱和度。

关键词：甲壳素；甲壳素酶；酶活；酶学性质 

目  录

中文摘要 I

英文摘要 II

目录 III

1. 绪论 1

1.1  甲壳素和壳聚糖的性质 1

1.2 微生物甲壳素酶的研究进展 2

1.2.1 能产生甲壳素酶的生物 2

1.2.2 微生物甲壳素酶的特点 3

1.2.2.1 诱导性 3

1.2.2.2 分泌性 3

1.2.2.3 多样性 3

1.2.3 微生物甲壳素酶的酶学性质 4

1.2.3.1 分子量 4

1.2.3.2 pH及最适pH值 4

1.2.3.3 温度 4

1.2.3.4 金属离子 4

1.2.4 微生物甲壳素酶的应用 5

1.2.4.1 进行细胞化学定位 5

1.2.4.2 分离真菌原生质体 5

1.2.4.3 制取甲壳低聚糖和N-乙酰葡糖胺 5

1.2.4.4 生物防治 5

1.2.4.5 生产单细胞蛋白 5

1.2.4.6 生产壳聚糖 5

1.3 酶的分离纯化 6

1.3．1 盐析 6

1.3.2 离子交换层析 6

1.3.3 亲和层析 7

2. 实验部分 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 样品来源 8

2.1.2 主要原料和试剂 8

2.1.3 主要仪器 8

2.1.4 培养基 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 胶体甲壳素的配制 9

2.2.2 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制 10

2.2.3 菌种分离与纯化 10

2.2.3.1 倒平板 10

2.2.3.2 制备样品稀释液 10

2.2.3.3 接种 10

2.2.3.4 初筛及纯化 10

2.2.4 摇瓶发酵培养 10

2.2.5 酶活测定 10

2.2.6 部分酶学性质测定 11

2.2.6.1 底物对甲壳素酶活力的影响 11

2.2.6.2 温度对甲壳素酶活力的影响 11

2.2.6.3 pH对甲壳素酶活力的影响 11

2.2.7 硫酸铵分级盐析 11

3. 结果与讨论 12

3.1 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的制作 12

3.2 平板分离筛选及摇瓶复筛 13

3.3 甲壳素酶高产菌株的特征 13

3.4 甲壳素酶的性质 14

3.4.1 底物对甲壳素酶活力的影响 14

3.4.2 温度对甲壳素酶活力的影响 15

3.4.3 pH对甲壳素酶活力的影响 16

3.5 最佳盐析浓度的确定 17

4．总结与展望 18

致谢 19

参考文献 20

附录A 21