人ACAT1基因的rs10753191位点SNP分析及可变剪接报告质粒构建
摘 要：酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离的胆固醇和脂肪酸合成胆固醇酯的酶，在胆固醇的吸收转运与代谢平衡调控中起非常重要的作用。ACAT基因家族包含ACAT1和ACAT2两个基因。ACAT1广泛的存在于几乎各种组织细胞中，调控细胞内的胆固醇代谢平衡；而ACAT2则在肝肠细胞中特异性表达，主要参与外源饮食和肝合成的胆固醇吸收酯化和载脂蛋白的装配。人类一些重要疾病如：高胆固醇血症、引起冠心病和中风的动脉粥样硬化、以及神经系统的阿尔海默氏疾病、消化系统的结石病等，都与ACAT密切相关。因此，ACAT已成为分子筛药的重要靶蛋白。
人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1（ACAT-1）mRNA序列来自两条不同的染色体（1q25和7q31.3），含各自启动子P1和P7。 通过计算机单核苷酸多态性（SNP）分析，发现1号染色体对应的genomic DNA（Exon1～Exon16）中Exon10的1032位置上有一个外显子剪接增强位点（ESE），将其C突变成T后，发现SR蛋白不能与ESE结合而发生选择性剪接。有统计表明正常人Exon10 的1032位点大多为C，而冠心病（CHD）病人大多为T。本论文在此基础上展开，首先，从不同来源的CHD血样中克隆包涵Exon10的genomic DNA，测序分析1032位点的碱基。再利用Tetra-primer ARMS-PCR方法进行基因型分析。在成功构建人ACAT1 genomic DNA（Exon8～11）质粒的基础上再利用Nested PCR将Exon10 1032位点上的C突变成T，确保只有这一个点发生突变。
关键词：ACAT-1基因,DNA克隆,基因型分析,Nested PCR,点突变
目 录
中文摘要 I
英文摘要 III
目录 V
1. 绪论 1
1.1 ACAT研究的历史背景 2
1.2 ACAT基因的克隆及ACAT家族的发现 3
1.3 ACAT-1基因的组织结构 4
1.4 ACAT的组织细胞分布与生物活性 4
1.4.1 ACAT的组织分布特异性 4
1.4.2 ACAT在细胞内的分布 5
1.4.3 ACAT的生物活性 6
2. 实验部分 7
2.1 材料及试剂 7
2.1.1 菌株和质粒 7
2.1.2 试剂 7
2.2 实验方法 7
2.2.1 正常人及冠心病人血样中genomic DNA的克隆 7
2.2.2 质粒DNA大量制备和纯化 8
2.2.3 Tetra-primer ARMS-PCR for genotyping SNPs 9
2.2.4 Nested PCR 9
3. 结果与讨论 12
3.1 结果 12
3.1.1 所需genomic DNA的获得 12
3.1.2 所得genomic DNA Exon 10 1032位置的测序 13
3.1.3 Tetra-primer ARMS-PCR 13
3.2 讨论 15
4．总结与展望 16
致谢 18
参考文献 19
