土曲霉lovastatin高产菌的基因组重排育种
摘要：洛伐他汀（lovastatin）是土曲霉（Aspergillus terreus）所产生的一种降血脂物质，它通过抑制体内胆固醇生物合成的关键酶HMG—CoA还原酶的活性而发挥作用。目前土曲霉菌种的发酵产量普遍偏低，本文将一种较新的育种方式基因组重排用于土曲霉菌种的选育，以提高其洛伐他汀的产量。初步探讨了耐前体和耐自身代谢产物突变株的筛选方法，对土曲霉原生质体的制备条件进行了研究，考察了菌体菌龄、酶种类、酶浓度等对土曲霉原生质体制备的影响。用紫外线灭活和热灭活对原生质体进行了灭活并初步进行了基因组重排实验。经过两轮基因组重排实验初步获得了具有潜在高产性能的10株抗性菌株（其中耐乙酸钠前体的抗性菌株6株，耐Lovastatin的抗性菌株4株）。
关键词: 土曲霉；洛伐他汀；紫外诱变；化学诱变；基因组重排
目 录
中文摘要 ………………………………………………………………………………………Ⅰ
英文摘要 ………………………………………………………………………………………Ⅱ
目录 ……………………………………………………………………………………………Ⅲ
1 绪论…………………………………………………………………………………………..1
1.1 前言 …………………………………………………………………………………..1
1.2 伐他汀的概况…………………………………………………………………………1
1.2.1 洛伐他汀的研究进展 …………………………………………………………1
1.2.2 洛伐他汀的生物合成…………………………………………………………..2
1.2.3 洛伐他汀的检测方法…………………………………………………………..2
1.3 洛伐他汀生产菌的菌种选育…………………………………………………………3
1.3.1 培养条件的优化………………………………………………………………..3
1.3.2 诱变育种………………………………………………………………………..4
1.3.3 原生质体技术………………………………………………………………….5
1.3.4 基因组重排技术……………………………………………………………….6
1.3.5 抗性突变株的筛选…………………………………………………………….7
1.4 本文的研究目标和思路 …………………………………………………………….7
2 实验部分 …………………………………………………………………………………….8
2.1 材料 …………………………………………………………………………………8
2.1.1 菌株 ……………………………………………………………………………8
2.1.2 培养基 …………………………………………………………………………8
2.1.3 药品 ……………………………………………………………………………8
2.2 实验仪器 …………………………………………………………………………….9
2.3 方法 ………………………………………………………………………………….9
2.3.1 单孢子悬液制备………………………………………………………………..9
2.3.2 乙酸钠抑菌浓度的确定………………………………………………………..9
2.3.3 Lovastatin浓度与抑菌圈大小的关系试验—圆滤纸片法 ………………….9
2.3.4 紫外诱变……………………………………………………………………….10
2.3.5 化学诱变……………………………………………………………………….10
2.3.6 原生质体的制备……………………………………………………………….11
2.3.7 原生质体的融合……………………………………………………………….12
2.3.8 原生质体的再生……………………………………………………………….13
2.3.9 基因组重排…………………………………………………………………….13
3结果与讨论 …………………………………………………………………………………15
3.1 菌株筛选方法的建立 ………………………………………………………………15
3.1.1乙酸钠浓度的确定 ……………………………………………………………15
3.1.2 lovastatin对菌株的抑制作用 …………………………………………………16
3.2 突变体原生质体的制备条件研究 …………………………………………………17
3.2.1 菌体菌龄对原生质体制备的影响…………………………………………….17
3.2.2 酶的种类对原生质体的影响………………………………………………….17
3.2.3 酶浓度对原生质体形成的影响……………………………………………….18
3.3 基因组重排育种 ……………………………………………………………………19
3.3.1 抗性突变株的筛选…………………………………………………………….19
3.3.2 抗性突变株的原生质体灭活的确定………………………………………….19
3.3.3 基因组重排及筛选结果……………………………………………………….20
4 总结与展望………………………………………………………………………………….22
致谢 ………………………………………………………………………………………….23
参考文献……………………………………………………………………………………….24
