摘要
棉花黄萎病是一种真菌性、世界性、毁灭性病害,对棉花产量有极大影响。它已成为我国棉花持续高产、稳产的主要障碍,并被称为“棉花癌症”[1]。1935年由美国引种时传入我国,近年来不仅国内北方棉区普遍发病,其他棉区也迅速扩展蔓延,对棉花生产造成巨大损失[2]。棉花黄萎病的病原菌主要为半知菌亚门轮枝孢属大丽轮枝菌。
实验目的：开展棉花黄萎病菌的遗传转化研究,为研究棉花黄萎病与棉花植物互作的机理提供基础准备。
实验方法：本实验采用以Pmg1基因为启动子驱动GFP基因表达的载体,pHMG和以TRPC为启动子的载体pBHt-1,分别转化农杆菌AGL-1,然后利用农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法将分别含有载体pBHt-1和pHMG的质粒农杆菌分别转化大丽轮枝菌T-9,经过抗生素筛选和显微镜形态鉴定（其中由载体pHMG得到的转化子用荧光显微镜鉴定）,菌丝培养,DNA的PCR鉴定证明得到了阳性转化子。
结果：本实验成功地将以Pmg1基因为启动子驱动GFP基因表达的载体pHMG和以trpC为启动子的载体pBHt1两个载体转化到大丽轮枝菌T-9菌株中,分别得到了pBHt1和pHMG的转化子。分别挑取两种转化子的基因组DNA,进行电泳检测,PCR鉴定,其中针对pHMG的转化子进行了荧光显微观察。荧光显微观察则更直观地证实获得了转GFP基因的大丽轮枝菌T-9菌株,该菌株已成功表达绿色荧光蛋白。
结论：本实验在前人筛选遗传转化的基础上进行,最终以载体pHMG实现了对大丽轮枝菌T-9的遗传转化,表明Pmg1基因作为启动子能够用于其他真菌的遗传转化。本研究发掘了Pmg1基因的新的应用价值。
关键词：棉花黄萎病；大丽轮枝菌；农杆菌介导的遗传转化；pHMG；pBHt
目录
摘 要
第1章棉花黄萎病研究概况............................1
1.1 黄萎菌概述..............................................1
1.1.1 棉花黄萎病简介....................................1
1.1.2 黄萎菌研究进展....................................1
1.1.3 大丽轮枝菌致病机理................................2
1.1.4 棉花黄萎病的防治..................................2
1.2 大丽轮枝菌遗传转化的研究进展............................2
1.3 研究目的及意义..........................................3
第2章实验设计......................................4
2.1 实验内容................................................4
2.2 实验技术关键............................................4
2.3 实验技术路线............................................5
第3章实验过程......................................6
3.1 材料与试剂..............................................6
3.1.1 材料..............................................6
3.1.2 酶与材料..........................................6
3.1.3 仪器设备..........................................6
3.1.4 培养基............................................6
3.2 农杆菌的转化.............................................6
3.3 利用ATMT法进行大丽轮枝菌T-9的遗传转化.................7
3.4 SDS-CTAB法提转化子基因组................................7
3.5 PCR检测................................................ 8
3.6 转化子的观察............................................9
第4章实验结果......................................10
4.1 基因组鉴定及PCR检测结果................................10
4.2 观察结果................................................11
4.2.1 载体pBHt1构建的转化子观察.........................11
4.2.2 空载体PHMG构建的转化子观察........................12
4.2.3 转化子PCR和荧光鉴定...............................12
4.2.4 转化子菌落形态观察.................................13
第五章总结与讨论...................................14
参考文献............................................15
致谢................................................17
