电场刺激下皮层神经细胞内DCC分子基因表达的研究

摘要

目的  根据建立的新生SD大鼠皮层神经元原代体外培养的方法培养皮层神经元，并对培养成熟的神经元做免疫荧光染色，以鉴定所培养的神经元。对所培养的神经元在不同电压下加载不同时间，明确不同条件电场刺激下神经导向分子受体DCC分子的基因表达水平。为研究电场与神经导向生长的分子机制奠定基础。方法 对体外培养的皮层神经元在电压为50mV、100mV条件下分别加载2h和4h，并对电场加载的神经元进行Tubulin-Ⅲ免疫荧光染色观察神经元在不同电场条件下的形态变化以及轴突长度的变化；以及通过RT-PCR以及Realtime PCR获取DCC分子的基因表达情况，确定DCC分子基因表达的最佳条件，为后续神经导向生长机制提供依据。结果 原代皮层神经元在体外培养情况下，7天可达最好细胞状态。电场刺激下神经元的轴突长度都有显著性地增加，DCC分子在电压为50mV条件下加载4h基因表达显著增加。结论 成功体外培养原代皮层神经元，初步确定了DCC分子基因表达最佳的电场刺激条件，具有一定实际意义和应用价值。

关键词：神经细胞的原代培养、电场加载、免疫荧光染色、DCC受体、RT-PCR

目录

1 绪论 1

1.1 概述 1

1.1.1 神经系统的功能与组成 1

1.1.2 神经细胞培养 1

1.1.3 神经细胞鉴定的主要方法 2

1.2 课题背景 3

1.2.1 神经损伤及修复 3

1.2.2 神经导向生长 5

1.3 研究目的 8

1.4 论文构成及研究内容 8

2 实验材料和方法 10

2.1 实验材料与设备 10

2.1.1 实验药品 10

2.1.2 实验器材 10

2.1.3 实验动物 10

2.2 大鼠皮层神经细胞原代培养 10

2.2.1 手术器械的高压消毒 10

2.2.2 DMEM高糖培养基过滤灭菌 11

2.2.3 细胞培养流程 11

2.3 电场加载实验 12

2.4 免疫荧光染色 12

2.4.1 准备细胞 12

2.4.2 染色流程 12

2.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰荧光素）染色 13

2.5.1 配制染色所需的试剂 13

2.5.2 染色步骤 13

2.6 RT-PCR检测DCC分子 14

2.6.1 总RNA的提取 14

2.6.2 反转录合成cDNA 15

2.6.3 PCR反应 16

2.6.4 DNA电泳检测 16

2.7 Realtime PCR检测DCC分子基因表达 17

3 实验结果与讨论 18

3.1 神经细胞原代培养 18

3.1.1 培养初期神经细胞 18

3.1.2 培养中期神经细胞 18

3.1.3 培养后期神经细胞 19

3.2 神经元染色结果 19

3.2.1 Tubulin-Ⅲ免疫荧光染色 20

3.2.2 DAPI核染以及叠加结果 22

3.2.3 FDA染色结果 24

3.2.4 不同电刺激电压及刺激时间条件下神经元轴突长度变化 24

3.3 RT-PCR检测DCC分子基因表达 25

3.3.1 所有实验组RT-PCR结果 25

3.3.2 RT-PCR灰度值统计结果 25

3.4 Real time PCR检测DCC分子基因表达结果 28

4 结论与展望 29

致谢 31

参考文献 32