核酸酶P1的初步分离纯化

核酸酶P1的初步分离纯化

摘要：5’—磷酸二酯酶是—类可将核酸定向水解为5’—核苷酸的酶，核酸是生命之源,核苷酸作为核酸的基本组成单元,是参与新陈代谢不可缺少的物质,而5’—核苷酸用途广泛, 它具有强烈的增鲜作用，是—类很有价值的食品增鲜剂，同时也是生产多种药物的原料。目前国外从核糖核酸生产5’—核苷酸的工艺大多应用桔青霉的核酸酶P1。本文主要是对纯酶制剂的制备纯化过程做了初步的研究。本人采用桔青霉发酵法生产5’—磷酸二酯酶，接着将发酵液进行多个的纯化步骤来得到较纯的酶制剂——核酸酶P1。经过85小时的发酵，滤去菌种，得到粗酶液，在4℃温度下纯化过程，它包括第—次硫酸铵沉淀、热处理、第二次硫酸铵部分沉淀、丙酮沉淀、葡聚糖凝胶G—75层析、冷冻干燥浓缩酶液等六个环节，将酶液进行初步的分离纯化，得到较纯的目标物，其中，每个环节通过测定酶活力并且进行SDS—PAGE胶分离的方式检验纯化效果。试验数据中可以得出：实验方案还是能利用桔青霉发酵生产得到含5′- 磷酸二酯酶的液体，并将5′- 磷酸二酯酶进行个初步纯化。试验中菌种的无菌培养，含目标酶液的保存，丙酮浓度的控制是试验的关键环节。

关键词：桔青霉； 5’—磷酸二酯酶；5’—核苷酸；酶活力；纯化

目录

中文摘要 I

英文摘要 II

目录 III

1．绪论 1

1.1  研究 5′- 磷酸二酯酶的背景和意义 1

1.1.1  5′- 磷酸二酯酶的定义 1

1.1.2   5′- 磷酸二酯酶的作用方式 2

1.1.3   5′-磷酸二酯酶的研究意义和前景 2

1.2  5′- 磷酸二酯酶的制备方法 3

1.2.1  提取法 3

1.2.2  发酵法 4

1.3  本课题的基本思路 4

1.3.1  实验的目的 4

1.3.2  实验流程 5

2．材料和方法 5

2.1 材料： 5

2.2 实验方法 6

2.2.1  菌种的活化 7

2.2.2  发酵培养 7

2.2.3  纯酶制剂的制备 7

2.2.4  酶活力的测定 13

3．结果与讨论 15

3.1 核酸酶P1的发酵 15

3.2 葡聚糖凝胶G-75层析纯化蛋白 15

3.3 各步骤纯化蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳 16

3.4 各步酶纯化试验结果 17

4．结束语 19

致谢 21

参考文献 22