摘 要
牛肉风味肽(BMP)是一种最初发现于牛肉中带有牛肉香味的八肽，因其独特的风味有望成为食品工业一种新型风味强化剂。本文主要对BMP的诱导表达条件、稳定性、预处理条件及分离纯化方法进行了如下研究：
优化了毕赤酵母工程菌的生长及发酵条件：种子培养温度为28℃，诱导期采用BSM为诱导培养基，诱导温度28℃，pH值3.0，转速190r/min，每24小时分批补加终浓度为0.5%(V:V)的甲醇诱导，1%酪蛋白水解物(CA)为氮源，最佳诱导时间为96小时，BMP产量最高可达623mg/L。
BMP的稳定性试验：90℃分别热处理5min、10min、15min、20min，BMP仍具有很好的稳定性；在pH3.0-8.0下室温放置48小时，均呈现较好的稳定性；抗蛋白酶水解试验证明，BMP具有很好的抗胃蛋白酶能力，而抗中性、碱性蛋白酶能力较弱。
发酵液预处理试验结果表明，因杂质同样具有较好的热稳定性，使得热处理法不适于前期的除杂质；活性炭吸附最佳pH值为7.0-8.0之间；乙醇沉淀除杂质最佳pH为7.0。
采用大孔树脂吸附法、离子交换法和凝胶过滤法对BMP进行粗分离，并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行定性和定量检测。经比较发现，葡聚糖G-25凝胶过滤法最终的得率、纯度及纯化倍数均高于其它两种方法。
利用RP-HPLC，采用二元梯度洗脱方法，通过两次制得的BMP纯品纯度达到95.26%。
关键词：牛肉风味肽；毕赤酵母；诱导表达；稳定性；分离纯化
目 录
1. 前 言 1
1.1 生物活性肽 1
1.1.1 生物活性肽的分类 1
1.1.2 生物活性肽的特点 2
1.1.3 生物活性肽的研究现状及应用前景 2
1.2 牛肉风味肽的研究进展 3
1.3 毕赤酵母表达系统概述 3
1.3.1 毕赤酵母表达系统的优点 4
1.3.2 毕赤酵母高密度发酵培养特点 4
1.3.3 影响毕赤酵母外源蛋白表达的发酵培养因素 5
1.4 多肽的分离纯化方法 5
1.4.1 离子交换层析（Ion-Exchange Chromatography） 6
1.4.2 凝胶过滤层析（Gel-Filtration Chromatography） 6
1.4.3 毛细管电泳色谱(CEC) 8
1.4.4 反相高效液相色谱（RP-HPLC） 8
1.5 本研究的目的和意义 10
1.6 本文的主要研究内容 10
2. 材料与方法 12
2.1 实验材料 12
2.1.1 主要实验试剂 12
2.1.2 实验仪器 13
2.1.3 菌种 13
2.1.4 溶液及培养基 14
2.2 实验方法 14
2.2.1 种子培养温度的确定 14
2.2.2 毕赤酵母工程菌株P.pastoris-BMP生长曲线的测定 14
2.2.3 最佳诱导时间的确定 15
2.2.4 毕赤酵母诱导表达单因素条件的优化 15
2.2.5 P.pastoris-BMP的优化条件下的培养及诱导表达 15
2.2.6 发酵样预处理 15
2.2.7 BMP的RP-HPLC检测 16
2.2.8 标准曲线的绘制 16
2.2.9 发酵液中风味肽稳定性试验 16
2.2.10 发酵液预处理试验 16
2.2.11 风味肽的前期粗分离 17
2.2.12 反相高效液相（RP-HPLC）制备BMP纯品 18
3. 结果与讨论 19
3.1 最适种子培养温度的选择 19
3.2 P.pastoris-BMP生长曲线的测定 19
3.3 BMP标准曲线的绘制 20
3.4 BMP最佳诱导时间的确定 20
3.5 诱导表达条件的优化 21
3.5.1 不同诱导温度对目标肽表达量的影响 22
3.5.2 不同pH值对目标肽表达量的影响 23
3.5.3 不同转速对目标肽表达量的影响 23
3.5.4 补充不同氮源对目标肽表达量的影响 24
3.6 发酵液中目标肽稳定性试验 26
3.6.1 热处理条件对发酵液中目标肽稳定性的影响 26
3.6.2 不同pH值对发酵液中目标肽稳定性的影响 27
3.6.3 发酵液中目标肽抗蛋白酶水解能力的研究 28
3.7 发酵液预处理试验 28
3.7.1 热变性沉淀杂质蛋白效果试验 29
3.7.2 不同pH值下活性炭去除发酵液中杂质效果的研究 29
3.7.3 乙醇沉淀杂质蛋白的试验 30
3.8 风味肽的分离与纯化 31
3.8.1 大孔树脂吸附法 31
3.8.2 离子交换层析(Ion-Exchange Chromatography) 33
3.8.3 凝胶过滤层析(Gel-Filtration Chromatography) 35
3.8.4 离子交换层析和凝胶过滤层析纯化效果的比较 36
3.9 反相高效液相（RP-HPLC）制备BMP纯品 37
4. 结论 39
4.1毕赤酵母发酵条件的优化 39
4.2目标肽的稳定性试验 39
4.3发酵液预处理试验 39
4.4分离纯化 39
4.5 RP-HPLC分析及制备 39
5. 展望 41
6. 参考文献 42
