兔出血症病毒遗传变异分析及RT—PCR检测方法的建立
摘 要：目的 获得兔出血症病毒（浙江分离株）近20年间遗传变异概况，建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法 对1989-2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因（VP60）进行了克隆与测序，并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析；根据兔出血症病毒株的VP60设计引物，对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果 7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成，编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0% ～ 99.8%。系统发生树分析结果显示，RHDV可划分为2个大的基因群，浙江（中国）的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带，而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测，13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性，3个阴性。检测敏感度达100%，特异性为99.12%, 经统计检验，kappa=0.865，表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论 RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测，用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。
关键词：兔病毒性出血症病毒；衣壳蛋白基因；遗传变异；RT—PCR
目 录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1. 绪论 1
1.1 兔出血症简介 1
1.1.1兔出血症的危害及特点 1
1.2兔出血症病毒（RHDV）的形态特征和基因组结构 1
1.3 实验动物兔出血症病毒（RHDV）的防治和检测方法 2
1.4本论文研究内容 4
2. 实验部分 5
2.1 材料 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 病毒的提取 5
2.2.2 核衣壳蛋白基因的克隆引物设计 5
2.2.3 RT—PCR扩增及RHDV核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定 5
2.2.4 参考毒株 6
2.2.5中国RHDV分离株的遗传变异分析 7
2.2.6兔出血症病毒RT—PCR检测方法的建立 7
3. 结果与讨论 9
3.1 RHDV核衣壳蛋白基因的克隆和鉴定 9
3.2分离的6株RHDV的核衣壳蛋白基因与国内外其它毒株的同源性分析 9
3.3 RHDV核衣壳蛋白基因的进化树分析 10
3.4 RT—PCR方法与检测结果 12
3.5 讨论 13
4．总结与展望 16
4.1 实验总结 16
4.1 实验展望 16
致谢 17
参考文献 19
