利用CRISPR在人细胞基因组内定点插入绿色荧光蛋白基因

中文摘要

CRI SPR/Cas 9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统是广泛存在于细菌和古细菌中抵抗外源核酸入侵的获得性免疫系统。最近该系统被用来对哺乳动物细胞的基因组进行定点编辑，取得了令人振奋的结果。其基本方法是利用Guide RNA来识别靶序列，当Guide RNA与靶序列结合后，与Guide RNA相结合的Cas9核酸剪切酶对靶序列进行定点切割。与其他基因定点编辑技术相比（如TALEN、ZFN等），CRISPR/Cas9具有简便、高效等优势。其强大的基因编辑功能有望在基因功能研究、基因治疗等领域发挥重要作用。本项目通过在293T细胞AAVS1位点定点插入绿色荧光蛋白基因来建立CRISPR/CAS9实验技术，设计了针对AAVS1的Guide RNA，对293T细胞进行转染并挑选正确插入的细胞克隆。本实验为今后利用该技术进行基因功能、基因治疗等方面的研究打下基础。

关键字：CRI SPR/Cas 9；基因定点编辑技术；293T细胞；细胞克隆

目录

中文摘要 1

Abstract 2

1绪论 5

1.1 CRISPR/CAS 简介 5

1.2 CRISPR 的分类及其研究现状 5

1.2.1不同类型的CRISPR 5

1.2.2 CRISPR/Cas 系统的结构 8

1.2.3CRISPR/Cas系统的原理 9

1.2.4 CRISPR/Cas系统的应用 10

1.2.5 CRISPR/Cas 系统研究现状分析 13

1.3研究意义 15

1.4研究目标及内容 17

2材料与方法 18

2.1实验材料 18

2.1.1菌株和质粒 18

2.2实验方法 19

2.2.1 293T细胞培养 19

2.2.2质粒扩增和纯化 20

2.2.3感受态细胞转化和筛选 20

2.2.4靶标序列的选择 21

2.2.5靶标序列插入pX330质粒 22

2.2.6模板质粒的构建（CXF） 23

2.2.7 293 T细胞转染 24

2.2.8 293T细胞克隆挑选 27

2.2.9 CRISPR/Cas9功能验证 28

3结果与分析 29

3.1 293T 细胞培养 29

3.2 靶标选择 29

3.3构建guide RNA-cas9 质粒 29

3.4构建模板质粒 31

3.5 293T转染细胞 31

3.6 293T细胞克隆挑选 33

致谢 34

参考文献 35