水杨酸合成酶AmS的异源表达、纯化以及生化性质鉴定

摘要

水杨酸合成酶，作为铁螯合剂生物合成的基本模块，可以充当一个比较有潜力的抗菌药物靶点。

我们从Amycolatopsis methanolica 239T铁螯合剂生物合成途径中发现了一种新型的水杨酸合成酶，AmS。系统发育分析表明，水杨酸合成酶的多样性较高。同时，我们发现这个水杨酸合成酶是一类比较新的类型。分析表明，AmS和Irp9以及MbtI的氨基酸序列有比较低的相似性，但是它们的活性位点是高度保守的。我们对AmS进行大肠杆菌异源表达，纯化以及进行体外实验初步鉴定其性质。实验表明，AmS的最适pH为8.0，最适温度为40 ℃。在低温下，AmS的活性pH范围比较窄，为pH=7-9。AmS催化分支酸形成水杨酸的Km值为323.8 μM，kcat为3.35 min-1，表明其和已报道的水杨酸合成酶比较，具有更低的底物选择性，但是速率还是和其他的持平。最重要的是，AmS表现出对有机溶剂和非离子型去垢剂较强的耐受性。

我们对AmS的研究不仅为水杨酸合成酶家族提供了一个新的成员，而且还通过对其部分性质的研究阐明了水杨酸合成酶潜在的应用前景。

关键词：铁螯合剂，水杨酸合成酶，药物靶点，动力学参数

目录

1 绪论 1

1.1 课题背景及目的 1

1.2 国内外研究状况 3

1.3 课题研究方法 4

1.4 论文构成及主要内容 4

2 研究方案 5

2.1 研究目标 5

2.2 材料及方法 5

2.2.1 仪器 5

2.2.2 材料 6

2.2.3 试剂 6

2.3 实验内容 6

2.3.1 amS基因与同类基因比对 6

2.3.2 引物设计 7

2.3.3 表达载体构建 7

2.3.4 蛋白表达与纯化 10

2.3.5 生化性质鉴定 13

3 实验结果 15

3.1 amS基因比对 15

3.2 引物设计 16

3.3 表达载体构建 17

3.4 蛋白表达与纯化 19

3.5 生化性质鉴定 20

4 讨论 24

5 展望 26

结论 27

致谢 28

参考文献 29

研究成果 30

附录A  CTAB法提取放线菌基因组 30

附录B 镍柱活化 32

附录C 乙醇沉淀 32

附录D 引物设计原则 32

附录F 实验原始数据 34